很想知道质粒构建的详细步骤 质粒构建的详细过程

很想知道质粒构建的详细步骤？

1.通过PCR扩增目的基因片段PCR要设计引物，设计引物时要选择合适的同源序列，根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点，PCR的产物要纯化。

2.酶切根据引物设计的酶切位点，分别对PCR产物和质粒载体进行酶切，酶切后的产物也要进行回收3.连接通过连接酶将酶切后的PCR产物和质粒载体进行连接4.转化将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a），涂板，培养过夜5.挑取单克隆，并鉴定挑去平板上的单克隆培养，可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序

延伸阅读

质粒构建的引物是什么？

如果是需要把一个特定的基因片段扩增后，插入到载体上构建质粒，则要根据载体上多克隆位点带有的酶切位点，在自己的目标基因片段上下游都分别设计一段序列，并在设计的序列中引入载体上的酶切位点。

这个时候设计出来，用于完成PCR扩增，并能够在目标序列上下游都引入酶切位点的两段序列就叫做质粒构建引物。这样扩增获得的目标片段两端就带有了酶切位点，经过酶切后，与同样经过酶切的载体就可以连到一起，形成环状，完成质粒的构建。

构建质粒载体的原则？

1、根据基因操作的工作要求。

2、符合理想载体的必备条件。

3、选择合适的亲本质粒提供运输载体。

4、尽量简化构建程序。

同源重组构建质粒原理及方法？

原理依赖于限制性核酸内切酶,DNA 连接酶和其他修饰酶的作用,分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后,将二者连接在一起,再导入宿主细胞,实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

传统的构建重组质粒的方法为TA克隆。该方法需要将构建进载体的片段通过PCR技术引入合适的酶切位点扩增出来，随后与T载体进行连接。将连接好的质粒转化大肠杆菌进行扩增，随后对扩增好的质粒进行酶切，得到含有粘性末端的片段。将该片段与同样经过双酶切的载体进行连接，转化大肠杆菌后即可得到重组质粒。